대장균에서 재조합 플라스미드 분리

Card Set Information

Author:
skhaii7
ID:
166340
Filename:
대장균에서 재조합 플라스미드 분리
Updated:
2012-08-16 22:55:56
Tags:
대장균에서 재조합 플라스미드 분리
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대장균에서 재조합 플라스미드 분리
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  1. 기본원리 : 대장균의 주염색체는 ( ) 로 존재하지만, 플라스미드는 ( ) 로 존재하기 때문에, pH 변화에 따른 구조변화가 적게 일어난다.
    • dsDNA
    • 초나선구조
  2. 실험과정
    ... 1. STE 완충액 첨가 후 현탁 - STE 완충액 역할
    대장균 표면에 묻어있는 배지성분 제거
  3. 용액I(포도당, EDTA, 완충액) 첨가 후 현탁 - 포도당, EDTA 역할
    포도당; 삼투압 유지 EDTA; Mg2+제거해서 세포벽 약화
  4. 용액II(NaOH, SDS) 첨가 - NaOH, SDS 역할
    • NaOH; 대장균(세균) 주염색체는 변성돼서 분리되버리고, 초나선구조의 플라스미드는 그대로 존재케 한다.
    • SDS; 지질 제거돼서 세포파괴
  5. 용액III(포타슘 아세테이트) 역할
    중화→대장균의 주염색체는 재생되며 엉겨 침전
  6. (일종의 용액IV) PCI solution(페놀/클로로포름/이소아미알콜) 첨가 후 원심분리 - 페놀, 클로로포름, 이소아미알콜 역할
    • 페놀; 단백질 변성해서 제거
    • 클로로포름; 페놀 제거
    • 이소아미알콜; 탄수화물 제거
  7. (일종의 용액V) (상층액/하층액) 에 에탄올or이소프로판올 처리 - ( / ), 용액 역할
    • (이것만 특이하게) 상층액
    • 플라스미드 침전시킴
  8. (일종의 용액VI) 에탄올 처리 - 역할
    염 제거 (염 존재시 DNA 조작에 사용되는 효소 활성이 억제됨)
  9. 최종 정량; 에탄올 제거→불투명 침전물 형성→( ) 측정하여 정량
    A260.

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